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文 | 林轻吟

编辑 | 林轻吟

●—≺ 摘要 ≻—●

脊索颗粒表面基因是维持脊椎动物索正常发育和稳定的必需基因，然而却在镜鲤肌间刺和椎骨组织中显著表达，暗示其可能与肌间刺和椎骨的发育有关｡

为探索ngs基因对肌间刺和主轴骨骼发育的影响，本研究以斑马鱼为实验对象，首先采用RNA荧光原位杂交证实了ngs基因与成骨细胞标志性基因sp7在肌间刺和椎骨组织中共表达｡

其次利用CRISPR/Cas9构建了ngs基因突变体胎发育观察显示ngs基因突变导致斑马鱼脊索发育异常。

90dph的突变体骨骼染色表明ngs*椎骨异常融合，肌间刺数量显著少于野生型的(P<0.05)｡

在90dph成鱼肌肉组织中，除bmp2bsmad5和runx2b在ngs一中的表达量显著低于野生型的(P<0.05)外，其他基因的表达量无显著差异｡

ngs基因突变导致了脊索发育异常，进而致使椎骨发育畸形，生长发育减缓，同时造成了肌间刺数量的减少。

胚胎成骨作用减弱椎骨发育异常，而在胚后发育阶段可能通过影响肌肉中bmp2bsmad5和rux基因的表达从而影响肌间刺的数量｡

●—≺ 试验与方法 ≻—●

饲养在水产科学研究所斑马鱼养殖系统中，光周期14/10h每天投喂2次丰年虫｡

采用90dph转基因斑马鱼用于ngs基因的RNA-FISH实验采用AB品系野生型斑马鱼用于ngs基因的CRISPR/Cas9基因敲除实验｡

取尾部组织采用4%多聚甲醛4C固定过夜采用LEICACM1900UV型号的冰冻切片机进行横切和纵切(厚度20um)。

参照Kishi等(2019)的实验方法进行RNA-FISH实验(探针见表1)，原位杂交结束后用1ug/mL的DAPI染料对细胞核进行室温染色5min｡

最后使用抗荧光衰减封片剂对RNAFISH的组织切片进行封片保存采用NikonE-CLIPSETi-E2显微镜观察基因的表达情况使用ImageJ软件对图像进行处理｡

从3个野生型家系与3个突变型家系中分别随机挑选42和64枚72hpf斑马鱼胚胎进行发育观察，同时分别随机选取10尾90dph的ngs-和野生型斑马鱼进行骨骼染色。

采用t检验分析野生型和突变体在斑马鱼胚胎发育的各时期，以及骨骼和肌肉组织中基因表达量的差异。

同时采用t检验分析野生型和突变体72hpf胚胎体长和90dph肌间刺数量的差异，数据统计采用SPSS24.0统计分析软件进行当P<0.05表示差异显著｡

●—≺ 结果 ≻—●

本研究采用RNA-FISH分析了ngs基因与成骨细胞标志性基因sp7的共表达情况｡

结果表明，在90dphTg转基因斑马鱼尾部组织的横切面中，sp7和ngs基因在肌间刺椎骨鳞片髓棘以及脉棘等组织中共表达。

此外ngs基因也在肌隔中表达，通过尾部组织纵切面的RNA-FISH分析，进一步证实了ngs基因在肌间刺组织中与sp7共表达，说明ngs基因可能与椎骨和肌间刺的发育有关｡

采用CRISPR/Cas9技术对ngs基因3号外显子的靶点进行了突变，构建了斑马鱼ngs基因突变纯合系，通过Sanger测序的序列分析发现ngs基因突变体在靶位点处缺失13bp｡

根据DNA序列推断的氨基酸序列分析发现，ngs基因突变体编码产物在第156个氨基酸处发生改变，在第172个氨基酸处出现终止密码子(图2A:图2B)｡

对ngs~-和野生型斑马鱼72hpf胚胎的显微观察发现，野生型胚胎脊索呈棒状，且脊索排列为规则的“硬币叠加”状。

而ngs突变体的脊索呈现不规则的颗粒状(图2E~图2G)由许多小囊泡组成(图2F)且在尾部出现了脊索破裂，呈弥散状(图2E;图2G)。

对ngs和野生型斑马鱼72hpf胚胎体长统计分析发现，ngs突变体体长(3.11mm+0.12mm，n=64)显著低于野生型的胚胎体长(3.59mm+0.13mm，n=42)(P<2.22X10-16)(图2H)｡

90dph成鱼骨染色发现，ngs突变体成鱼椎骨出现了不同程度的异常融合。

对肌间刺数量的统计分析发现，与野生型的肌间刺数量(91.7+4.6，n=10)相比，ngs-突变体的肌间刺数量(87.3+1.6，n=10)显著减少，肌间刺数量减少了4.8%(P<0.05)｡

以上说明，ngs基因突变后导致了胚胎期脊索结构的破坏，造成了成鱼椎骨异常融合、胚胎期体长生长缓慢，并导致了90dph突变体斑马鱼肌间刺数量的减少。

12个骨骼发育相关基因在胚胎不同发育时期的表达情况如图3所示｡

bmp2b、smad4a、smad5、sp7和bglap5个基因的表达量在ngs-突变体与野生型斑马鱼的整个胚胎发育时期总体均呈现下降的趋势bmp2a、collala和sost3个基因表达量均呈现上升趋势。

bmp6和smad1基因的表达量在胚胎发育前期先是升高，后期逐渐下降;run2a和runx2b基因在野生型中的表达量是先下降后上升，而在突变体中则相反｡

在胚胎发育的体节期(12hpf)，bmp6、bmp2a、smadl_smad5、smad4a、runx2b、collalasp7和sost基因在突变体中的表达量显著低于野生型的(P<0.05)｡

在咽囊期(24hpf)，runx2abmp2a、smad4asmad5、sp7、sostbglap7个基因在突变体中的表达量显著高于野生型的(P<0.0)。

而collala基因在突变型中的表达量显著低于野生型的(P<0.001)，在原基-25期(36hpf)，smadlrunx2b和bglap3个基因在突变体中的表达量显著高于野生型的(P<0.05)。

而bmp6_bmp2abmp2b、collala和sp7在突变型中的表达量显著低于野生型的(P<0.05)｡

在孵化期(48hpf)，除smad1和runx2b基因外其余基因在突变体中的表达量均显著低于野生型的(P<0.05)｡

在早幼期(72hpf)，runx2b基因在突变体中的表达量显著高于野生型的，而bmp2b、bmp6smadI、runx2acollalabglap和sost基因在突变体中的表达量均显著低于野生型的(P<0.05)｡

根据成骨细胞标志基因runx2a、runx2bsp7、colala和bglap，以及骨细胞标志基因sost的表达量对比分析发现。

在斑马鱼胚胎发育后期(48hpf和72pf)ngs--突变体的成骨作用显著弱于野生型的。

而BMP和SMAD家族相关基因在突变体中的表达量也发生了紊乱，说明ngs基因功能异常可能通过影响骨发育相关调控因子的表达量变化。

从而抑制突变体中的成骨作用，导致ngs基因突变抑制了斑马鱼胚胎期骨骼的发育.造成了胚胎期生长发育缓慢和滞后｡

在90dph野生型与ngs突变体斑马鱼的骨骼组织中，12个骨骼发育相关基因的表达量无显著性差异(P>0.05)(图4)。

但在尾部肌肉组织中，bmp2b_smad5和runx26在突变体中的表达量显著低于野生型的(P<0.05)，其他基因表达差异不显著。

综合bmp2bsmad5和runx2b基因在TGF-B信号通路中参与调节成骨细胞及骨发育的过程可知，上述三个基因的差异表达可能影响了ngs突变体中肌间刺的数量｡

●—≺ 讨论 ≻—●

ngs基因被认为在斑马鱼早期脊索发育中起到关键作用，但其在成体中的空间表达及对后期骨骼发育的作用仍不清晰｡

本研究应用RNA-FISH，首次揭示了ngs基因在90dph斑马鱼尾部组织中的表达模式，明确了其在椎骨、肌间刺和肌隔组织中的表达。

验证了鲤肌间刺组织转录组分析中ngs基因，在椎骨和肌间刺组织中显著性表达的这一结论。

ngs基因在椎骨、肌隔、肌间刺组织中具有清晰的表达，推测ngs基因在肌间刺和骨骼发育中发挥着作用｡

同时ngs基因与成骨细胞标志基因sp7在椎体和肌间刺组织中共表达，说明成骨细胞应可以表达ngs，但肌隔组织上仅有ngs的表达。

暗示肌隔中可能存在表达ngs基因的细胞，或者肌睫发育相关的细胞也可能表达ngs基因(肌腿位于肌隔内)，这需要进一步对ngs与肌睫细胞标志性基因进行共表达分析｡

CRISPR/Cas9基因组编辑具有结构简单、高效以及脱靶率较低等优势而被广泛应用于基因功能研究中。

为研究ngs基因与椎骨和肌间刺发育的相关性，本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了ngs基因突变的纯合系。

同野生型斑马鱼的“硬币叠加”状的脊索相比ngs-突变体斑马鱼脊索呈不规则的颗粒状，并在尾部出现脊索断裂。

骨骼发育涉及成骨细胞和破骨细胞的分化和表达，成骨细胞在骨骼发育中起着关键作用｡

BMP蛋白家族基因参与调控骨形成相关因子的起始与表达，其中bmp2可调控成骨细胞前体向成骨细胞分化。

Bmp6可在成骨细胞分化早期介导糖皮质激素促进成骨细胞分化，其次也在成熟的软骨细胞中表达以促进软骨细胞向成骨细胞发育。

●—≺ 总结 ≻—●

综上所述，本研究分析了ngs基因对斑马鱼肌间刺和骨骼发育的影响，首次揭示了ngs基因在椎骨和肌间刺组织中与成骨细胞标志性基因sp7共表达的现象，并构建了ngs-突变系。

通过胚胎骨骼发育观察和骨发育相关基因的RT-qPCR分析，推测ngs基因突变导致脊索功能异常，从而抑制脊索分泌BMP信号通路相关因子。

使ngs突变体成骨作用减弱致使生长发育滞后，并使脊椎发育异常。

同时ngs基因可能通过调控bmp2b_smad5和runx2b的表达，影响肌间刺的发育，致使肌间刺数量减少｡

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